Etter 25 dager med statisk inkubasjon ved 28 °C viste lakkase fra *Pleurotus ostreatus* NRC620 den høyeste aktiviteten i soppkulturmediet. De optimale pH- og temperaturverdiene for dette enzymet var henholdsvis 3,0 og 70 °C. Etter 2 timers inkubasjon ved 40 °C og 50 °C beholdt enzymaktiviteten henholdsvis 68,33 % og 59,61 %. Etter 2 timers inkubasjon i citrat-fosfatbuffer (pH 7,0) forble enzymaktiviteten på 100 %. Tilsetning av 10 mM MgSO₄ og CuSO₄ økte enzymaktiviteten med henholdsvis omtrent 21 % og 35 %, mens NaCl, MnCl₂, KCl og CaCl₂ hemmet enzymaktiviteten. Ved bruk av ABTS som substrat var de kinetiske parametrene (Km og Vmax) til *Pleurotus ostreatus* NRC 620 lakkase henholdsvis 1,99 mM og 16 217 μmol min−1 L−1. Enzymatisk behandling av eplejuiceprøver reduserte både pH og viskositet betydelig, og denne reduksjonen korrelerte med en økning i lagringstid. Lakkasebehandling resulterte i en liten reduksjon i det totale fenolinnholdet i eplejuice, men ingen reduksjon i antioksidantaktivitet ble observert.
I de senere årene har forskere fokusert på anvendelsen av grønn bioteknologi i næringsmiddelindustrien. Lakkase er et av de mest nyttige enzymene i næringsmiddelindustrien, og finner anvendelser innen områder som juiceforedling, baking, vinstabilisering og forbedring av de organoleptiske egenskapene til matvarer.1Mange høyere planter og mikroorganismer skiller ut lakkase,2og sopp som deuteromyceter, ascomyceter og basidiomyceter kan også produsere lakkase.3Lakkase (EC 1.10.3.2) er en blå oksidase som reduserer molekylært oksygen til vann ved hjelp av et system bestående av tre forskjellige kobberatomer, og dermed oksiderer forskjellige fenolforbindelser og aromatiske aminer. Under produksjonen av frukt- og grønnsaksjuicer er enzymatisk og ikke-enzymatisk bruning kritiske problemer.4Siden disse stoffene påvirker fargen, smaken og aromaen til juicen negativt, må de fjernes.5
Av alle frukter er epler den mest konsumerte på verdensbasis og i EU. I 2019 var epleproduksjonen rangert som nummer tre globalt, med over 87 millioner tonn.6Epler inneholder en rekke fenoliske forbindelser, inkludert flavonoider og fenoliske syrer som kaffesyre og klorogensyre.7Fordi eplejuice vanligvis konsumeres i sin klare form, går omtrent 50 % til 90 % av fenolkomponentene tapt under filtreringsprosessen.8I dag har forbrukere en tendens til å velge minimalt bearbeidede produkter, som uklar eplejuice med høyt polyfenolinnhold. På grunn av det høye fenolinnholdet er imidlertid denne typen eplejuice spesielt utsatt for misfarging og mørkning.9Ulike teknologier, inkludert varmebehandlingsmetoder som pasteurisering ved 60–90 °C, brukes til å redusere eller forhindre mørkfarging av eplejuice.10Imidlertid ifølge forskning fra Sauceda-Gálvez11, termisk prosessering kan ødelegge flyktige kjemikalier og påvirke de organoleptiske egenskapene til eplejuice. Alternativer til termiske prosesseringsmetoder inkluderer superkritisk karbondioksid, ultrafiolett stråling, ultralyd, høyt hydrostatisk trykk eller høytrykkshomogenisering.12Effektiviteten til disse teknologiene og utbyttet av passende fruktjuicer avhenger av parameterne som brukes og produktegenskapene. Den utbredte bruken er begrenset av høye kostnader, negative effekter på kvaliteten på enkelte matvarer eller utilstrekkelig enzyminaktivering.13,14
Lakkase kan brukes til å stabilisere og klargjøre fruktjuice.15Gökmen et al.16anbefaler bruk av lakkase for klaring av fruktjuice fordi det effektivt fjerner fenolforbindelser ved å omdanne dem til polymerer eller oligomerer som lett fjernes av enhver ultrafiltreringsmembran, slik at eplejuice kan opprettholde stabil farge og klarhet i opptil seks uker ved 50 °C. Renset *Trichoderma*-lakkase ble immobilisert på aluminakuler og brukt til selektivt å fjerne bismaksforbindelser forårsaket av mikrobiell forurensning av eplejuice.17
Omtrent 80–90 % av de flyktige komponentene i eplejuice er estere og aldehyder, som gir juicen en unik aroma.18Lakkase fra *Trametes versicolor* ble immobilisert på et rimelig underlag laget av naturlig fiber fra unge kokosnøttskall for klaring av eplejuice.19Tidligere studier har undersøkt stabiliseringen av eplejuice (farge og turbiditet) ved bruk av enzymfrie eller immobiliseringsmetoder, eller i kombinasjon med ultrafiltrering.5,19Effekten av soppelakkaser på de fysisk-kjemiske egenskapene til eplejuice under lagring er imidlertid fortsatt uklar. Målet med denne studien var derfor å eksperimentelt undersøke endringene i de fysisk-kjemiske egenskapene, innholdet av fenolforbindelser og antioksidantaktiviteten til eplejuice etter behandling med soppelakkaser og to ukers kjølig lagring. Lakkaser har evnen til å oksidere fenolforbindelser, noe som gjør dem lovende for bruk i ulike industrielle prosesser, inkludert juiceklaring. Denne studien undersøkte lakkaser fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620, med fokus på de ideelle forholdene for deres aktivitet og effektivitet i juiceklaring. Selv om forskning på østerssopp (P. ostreatus NRC 620) fortsatt er begrenset, har tidligere studier undersøkt enzymer fra ulike soppkilder, som Trametes versicolor og Ganoderma lucidum. Målet med denne studien var å evaluere den potensielle anvendelsen av dette enzymet i næringsmiddelindustrien og fremheve dets unike egenskaper, spesielt dets ideelle pH og temperatur.
2,2'-Azooxybis(3-etylbenzotiazolin-6-sulfonsyre) (ABTS) ble kjøpt fra Sigma-Aldrich (Canada). Alle andre reagenser var av analytisk kvalitet.
Det nasjonale forskningssenterets senter for mikrobiell kulturinnsamling innhentet den kjente østerssoppstammen NRC620. Etter subkultur ble denne stammen lagret på potetdekstroseagar-skråplater ved 4 °C. Inokulumtilberedningsmetoden var som følger: 10 dager gammelt, fullt utviklet mycel ble inokulert på potetdekstroseagarplater og inkubert ved 28 °C. Etter 10 dager ble tre mycelblokker med 12 mm diameter fjernet fra agarmediet ved hjelp av en steril metallstempel og plassert i 250 ml Erlenmeyer-kolber med bomullspropp som inneholdt 50 ml sterilisert kulturmedium (pH 5,0, som tidligere beskrevet av Othman et al.20Kulturene ble inkubert ved 28 °C i 18 dager. Kulturene ble deretter filtrert gjennom Whatman nr. 1 filterpapir, og den resulterende supernatanten fungerte som enzymkilde.
Lakkaseaktivitet ble bestemt ved bruk av ABTS som substrat. Reaksjonsblandingen (2 ml) inneholdt 500 μl 0,3 mM ABTS (oppløst i 0,1 M natriumcitratbuffer, pH 4,5) og den nødvendige mengden enzymprøve fortynnet med destillert vann.21,22Tatt i betraktning at lakkase kan oksidere ABTS ved romtemperatur (28 °C ± 2), ble ABTS-oksidasjon bestemt ved å måle økningen i absorbans ved 420 nm (ε420= 36 000 cm²-1 M -1) ved bruk av et Agilent Carry-100 UV-spektrofotometer. Én enhet lakkaseaktivitet var nødvendig for å oksidere 1 μmol ABTS per minutt. Proteinkonsentrasjonen ble bestemt ved Bradford-metoden med bovint serumalbumin som intern kontroll.23,24
Etter å ha utvunnet enzymet fra østerssoppstammen NRC 620, ble aktiviteten målt ved forskjellige dyrkingsintervaller i 25 dager under statiske forhold ved 28 °C.
For å studere effekten av temperatur på lakkaseaktivitet ble det utført eksperimenter i temperaturområdet fra 20 til 90 °C. Før enzymet ble tilsatt og reaksjonen startet, ble bufferen (0,1 M natriumsitrat, pH 4,5) og substratet (ABTS) blandet og inkubert i 5 minutter ved forskjellige temperaturer. Enzymets termiske stabilitet ble vurdert ved inkubering i 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) ved henholdsvis 40, 50, 60 og 70 °C i 2 timer. Restaktivitet ble deretter vurdert ved bruk av ABTS-substratet.
Effekten av pH på lakkaseaktivitet ble vurdert ved bruk av ABTS som substrat i 0,1 M citrat-fosfatbuffere med et pH-område fra 2,5 til 7,0. Enzymløsningen ble inkubert ved 40 °C i to timer i 0,1 M citrat- og Tris-buffere (pH 3, 4, 6 og 7) for å vurdere pH-stabilitet. Restaktivitet med ABTS som substrat ble beregnet etter inkubasjon.
Lakkasen ble inkubert i 10 minutter i natriumfosfatbuffer (0,05 M, pH 7,0) som inneholdt forskjellige metallioner (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+ og Mn2+) i konsentrasjoner på henholdsvis 2,5 mM og 10 mM. Substratet (ABTS) ble deretter tilsatt for å starte reaksjonen, og den relative aktiviteten ble vurdert.
ABTS-oksidasjon med lakkase ved forskjellige konsentrasjoner (0,025–3 mM) ble målt ved pH 4,5 for å bestemme de kinetiske parametrene (Vmax og Km). Den kinetiskekonstanterav Michaelis-Menten-ligningen ble beregnet ved hjelp av et Lineweaver-Burk-plott, som plotter den resiproke verdien av reaksjonshastigheten som en funksjon av substratkonsentrasjonen. De kinetiske konstantene ble beregnet fra Lineweaver-Burk-plottet ved hjelp av GraphPad Prism versjon 6.01-programvaren.
Etter å ha vasket eplene grundig med vann fra springen, ble de delt i to og presset ut juice med en helautomatisk Braun MP80 eplejuicer (produsert i Tyskland). Juicen ble filtrert gjennom fire lag med osteklede. Ingen enzymer ble tilsatt kontrollgruppen, mens 2,0 % lakkase (den mest effektive konsentrasjonen som ble testet) ble tilsatt til fersklaget eplejuice, som deretter ble lagret ved 4 °C i to uker.
Titrerbar surhet (TA) og pH ble bestemt i henhold til metoden til Boulton et al.al.27PH-verdien i hver prøve ble målt med et digitalt pH-måler (JENWAY 3510 pH-måler). Titrerbar surhetsgrad (TA) ble beregnet basert på eplesyre ved hjelp av følgende formel.
Hvor V og C er henholdsvis volumet (ml) og konsentrasjonen (0,1 mol/l) av natriumhydroksidløsningen som ble brukt i titreringen. K er eplesyreomdannelseskoeffisienten, lik 0,067, og W er massen (g) av eplejuice.
Totalt antall løselige faste stoffer (TDS)-innholdet i alle juiceprøvene ble bestemt ved hjelp av et PAL-1 lommerefraktometer (ATAGO, Tokyo, Japan). Etter hver måling ble den optiske linsen skylt med avionisert vann, og hver eplejuiceprøve ble testet tre ganger. Verdien for hver prøve ble beregnet ved å beregne gjennomsnittet av de tre målingene. Gjennomsnittet ± standardavviket for hver eplejuiceprøve ble også beregnet ved å beregne gjennomsnittet av disse resultatene.
Viskoelastisiteten til eplejuiceprøvene ble vurdert ved hjelp av et rotasjonsviskosimeter (RV, Rheotest 2, Tyskland). Prøven ble plassert inne i viskosimeterets «S2»-sylinder. Tilsynelatende viskositet ble representert ved hellingen til skjærspennings- versus skjærhastighetskurven, som ble beregnet ut fra skjærspenningen og de tilsvarende kurvene ved forskjellige skjærhastigheter (fra 1,00 til 437,4 s⁻¹). Formelen for å beregne tilsynelatende viskositet er som følger:
Der η er den tilsynelatende viskositeten (cP), τ er skjærspenningen (dyn/cm²), γ er skjærhastigheten (sec⁻¹), og (τ) beregnes ved å bruke dreiemoment- (α) og sylinder- (Z) verdiene ved å bruke følgende formel: τ = Z . α.
Bruningsindeksen ble bestemt i henhold til metoden til Meidav et al.al.29En 10 ml juiceprøve ble sentrifugert ved 2750 xg i 10 minutter. 5 ml av juicesupernatanten ble blandet med 5 ml 95 % etanol. Blandingens absorbans ble målt ved 420 nm ved bruk av et Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC).
Totalt fenolinnhold (TPC) ble bestemt kolorimetrisk ved bruk av Folin-Ciocalteu-reagenset som beskrevet av Boulton et al.[27]En standardkurve for gallussyre ble konstruert for konsentrasjoner fra 0 til 500 mg/L (r²= 0,997). Resultatene er uttrykt som gallussyreekvivalenter (mg GAE/ml).
Tilsett 125 μL destillert vann og 2850 μL FRAP-løsning til 25 μL eplejuice og la blandingen stå i mørket i30min. Mål deretter absorbansen ved 593 nm ved bruk av et Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). FRAP-reagenset ble fremstilt ved å blande 300 mM acetatbuffer (pH 3,6), 20 mM jern(III)klorid og 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl)triazin (TPTZ) (oppløst i 40 mM HCl) i et forhold på 10:1:1. En standardkurve ble generert ved bruk av Trolox som standard (R²= 0,999), og resultatene er uttrykt som μM Trolox/ml.
Antioksidantaktiviteten til de behandlede og ubehandlede juicene ble bestemt ved hjelp av DPPH-metoden for å evaluere deres evne til å fange opp DPPH-frie radikaler.31Ti mikroliter juice ble blandet med 1 ml av en DPPH-løsning (100 μM) i metanol. Etter reaksjon i mørket i 30 minutter ble blandingens absorbans målt ved 517 nm ved bruk av et Shimadzu UV-spektrofotometer (UV-1601 PC). Resultatene ble uttrykt som troloksekvivalenter (μM troloks/ml) basert på en kalibreringskurve (R2= 0,990).
Dataene som ble innhentet viste at maksimal lakkaseproduksjon ble observert i NRC 620 østerssopp ved slutten av den 18. dagen av fermenteringen, med en aktivitet på 1302 U/L. Dette tjente som grunnlag for å bestemme den optimale dyrkingstiden for lakkaseproduksjon (figur 1). Selv om enzymproduksjonen økte med økende dyrkingstid, var økningsraten ikke direkte proporsjonal med dyrkingstiden; etter 21 dager hadde enzymaktiviteten bare økt med 90 U/L (til 1390 U/L). Derfor ble 18 dager til slutt valgt som den optimale dyrkingstiden for å balansere produktutbyttet med de økonomiske fordelene ved økt dyrkingstid.
Effekt av dyrkingstid på lakkaseutbytte i Pleurotus ostreatus NRC 620. Tre (12 mm) soppmycelblokker ble inokulert i 50 ml sterilt medium og deretter dyrket ved 28 °C i forskjellige tidsperioder.
I samsvar med andre studier indikerer resultatene våre at den ideelle kulturperioden for å oppnå maksimal lakkasesekresjon av sopp sannsynligvis er mellom 7 og 36 dager.32Ifølge Ezike et al.33, *Trametes polyzona* WRF03 produserte den høyeste mengden lakkase ved slutten av den niende dagen av fermenteringen, med en spesifikk aktivitet på 1637 U/mg protein. Videre har Othman et al.34fant at *Trichoderma harzianum* S7113 skilte ut en stor mengde lakkase på den femte dagen av dyrkingen. Lakkaseproduksjonshastigheten nådde en toppaktivitet på den fjortende dagen og avtok deretter gradvis.34Selv om enzymsekresjon også kan forekomme i løpet av hovedvekstfasen, topper den seg vanligvis i mellomfasen og utløses av forbruk av en karbon- eller nitrogenkilde.34,35
Selv om lakkase fra Pleurotus ostreatus NRC 620 viste høy aktivitet over et bredt temperaturområde fra 50 °C til 80 °C, nær toppaktivitet (69–98 %), ble den maksimale aktiviteten observert ved 70 °C (fig. 2a). Utenfor dette temperaturområdet minket enzymaktiviteten ved omtrent 70 °C. Disse resultatene tyder på at enzymet er aktivt ved høye temperaturer, sannsynligvis fordi høy temperatur øker reaksjonens kinetiske energi.
Effekt av reaksjonstemperatur (a) og pH (b) på lakkaseaktivitet i *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperaturer fra 20 til 90 °C ble oppnådd ved å forinkubere blandingen ved forskjellige temperaturer i 5 minutter før enzymet ble tilsatt og reaksjonen startet. Effekten av pH på lakkaseaktivitet ble vurdert ved bruk av ABTS som substrat i løsninger som inneholdt 0,1 M citrat-fosfatbuffer over et pH-område på 2,5 til 7,0.
Ifølge Ezike et al.al.33, den optimale temperaturen for *Trametes polyzona* WRF03 lakkase er 55 °C, som er den samme som for *Ganoderma lucidum*laccase36og ligner den optimale temperaturen (50 °C) for *Trametes polyzona* KU-RNW02737lakkase . Baldrian38bemerker at, som for andre lignin-nedbrytende enzymsystemer, er det ideelle temperaturområdet for lakkase mellom 50 og 70 °C.
Resultatene viste at enzymet hadde høyest aktivitet ved pH 3,0, og nådde 94 % aktivitet ved pH 3,5. Det forble imidlertid aktivt over et bredt pH-område fra 2,5 til 7,0 (figur 2b). Videre viste det høyere aktivitet under sure forhold sammenlignet med nøytrale eller alkaliske forhold. Aktiviteten forble minst 77 % over pH-området fra 2,5 til 4,5, men nådde bare omtrent 38 % ved pH 7,0. Den optimale pH-verdien for lakkase fra *Trametes polyzona* WRF03 var 4,533, som er den samme som pH-verdien for lakkaser fra *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzanium* 39, *Pleurotus* sp. 40 og *Trametes hirsuta* 41. Imidlertid, ifølge studien av Chairin et al.42, den optimale pH-verdien for lakkase fra *Polymorpha f. sp.* WR710-1 er 2,2, mens den optimale pH-verdien for lakkase fra *Polymorpha f. sp.* IBL-04 er 5,043. Bindingen av hydroksidanioner (lakkasehemmer) til kobberatomene i T2/T3-lakkase kan være årsaken til den reduserte lakkaseaktiviteten under nøytrale eller alkaliske pH-forhold. Dette kan forstyrre den interne elektronoverføringen fra T1-senteret til T2/T3-senteret, og dermedbegrensendeenzymaktiviteten23,44
Ved å inkubere enzymet ved forskjellige temperaturer ble det funnet at både inkubasjonstid og temperatur påvirket enzymstabiliteten. Det er verdt å merke seg at lakkase fra *Trametes polyzona* NRC 620 viste høyere stabilitet ved 40 ℃ og 50 ℃, og beholdt henholdsvis 68,33 % og 59,61 % av sin opprinnelige aktivitet etter 120 minutter (figur 3a). I motsetning til dette, under de samme forholdene (40 ℃ og 50 ℃, 120 minutter), beholdt lakkase fra *Trametes polyzona* WRF03 henholdsvis 64,38 % og 42,92 % av sin aktivitet.33Økt inkubasjonstid og temperatur reduserte derimot stabiliteten til *Trametes polyzona* NRC 620-lakkase. Etter inkubasjon ved 60 ℃ og 70 ℃ i 60 minutter, sank aktiviteten til henholdsvis 39,24 % og 1,72 % (figur 3a). I samsvar med de eksperimentelle resultatene viste lakkase fra *Trametes polyzona* WRF03 høyere stabilitet ved 40 og 50 ℃ gjennom hele den termiske behandlingsprosessen.33På samme måte har Lueangjaroenkit et al.al.37og Chairin et.al.42rapporterte stabiliteten til lakkaser fra Trametes polyzona KURNW027 og Trametes polyzona WR710-1 ved henholdsvis 50 °C i 1 time. Som en nyttig biokatalysator som kan anvendes innen ulike bioteknologiske felt, bør lakkase ha god stabilitet og ytelse over et bredt temperaturområde.
Termostatisk stabilitet (a) og pH-stabilitet (b) for lakkase fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Termostatisk stabilitet ble vurdert ved å inkubere enzymløsningen i 0,05 M natriumfosfatbuffer (pH 7,0) ved henholdsvis 40, 50, 60 og 70 °C i 2 timer. pH-stabilitet ble vurdert ved å inkubere enzymløsningen i 0,1 M sitratbuffer og Tris-buffer (pH 3, 4, 6 og 7) ved 40 °C i 2 timer. Restaktivitet ble beregnet ved bruk av ABTS som substrat etter inkubasjon.
For å bestemme de optimale forholdene for enzymbruk og -lagring, undersøkte vi effekten av pH på lakkase-stabilitet. Eksponering for forskjellige pH-verdier påvirket proteinstrukturens stabilitet betydelig, og dermed enzymmolekylets stabilitet og aktivitet. Resultatene viste at enzymet var mindre stabilt under sure forhold, mens det viste bedre stabilitet ved høyere pH-verdier (nøytrale og alkaliske områder). Ved pH-verdier på 7,0, 6,0, 4,0 og 3,0 var enzymretensjonsratene etter 120 minutter henholdsvis omtrent 100 %, 62,54 %, 52,39 % og 11,14 % (fig. 3b). *Strombus multisus* WRF03-lakkase viste høyere stabilitet ved nøytrale pH-verdier (5,5–6,5) og lavere stabilitet ved sure pH-verdier (under 4,0). Etter 120 minutter ved pH-verdier på 5,5, 6,0 og 6,5 var enzymretensjonsratene henholdsvis omtrent 82 %, 100 % og 93 %.33Khairin et al.42bemerket at lakkase fra Trametes polyzona WR710-1 var stabil i pH-området 6,0 til 7,0, mens Sayed et al.45viste at lakkase var mer stabil under nøytrale pH-forhold. Lakkase fra Cerrena unicolor viste imidlertid også stabilitet under alkaliske forhold (pH 9,0).46Lakkasene som ble studert viste høy stabilitet over et bredt pH-område. Dette kan være en viktig egenskap for industrielle anvendelser.
Siden noen metallioner har både stimulerende og hemmende effekter på enzymaktivitet, må deres effekter på enzymaktivitet vurderes i industrielle applikasjoner. Dette er avgjørende fordi metallioner er vanlige miljøgifter som kan påvirke stabiliteten og syntesen av ekstracellulære enzymer.47For å undersøke effektene av flere metallioner på lakkase fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620, utførte vi tilsvarende eksperimenter. Som vist i figur 4, påvirket en økning av metallionkonsentrasjonen fra 2,5 mM til 10 mM enzymfunksjonen negativt, avhengig av hvilken type metall som ble brukt. For eksempel,Mg²⁺ , Co²⁺ , Zn²⁺, ogCu²⁺kunne stimulere og aktivere enzymaktiviteten, samtidig somNa⁺ , Mn²⁺ , Ca²⁺, ogK⁺kunne hemme enzymaktiviteten. Ved en konsentrasjon på 10 mM var Cu²⁺- og Mg²⁺-ioner de mest potente aktivatorene av lakkaseaktivitet fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620, og ga en aktiveringsgrad på henholdsvis omtrent 34 % og 20 %. Ved en konsentrasjon på 10 mM var imidlertid Ca²⁺-ioner den mest potente hemmeren av lakkase, og reduserte enzymaktiviteten med omtrent 60 %.
Effekten av metallioner på aktiviteten til Pleurotus ostreatus NRC 620-lakkase. Lakkasen ble inkubert i 10 minutter i natriumfosfatbuffer (0,05 M, pH 7,0) som inneholdt forskjellige metallioner i konsentrasjoner på 2,5 mM og 10 mM. Reaksjonen ble deretter initiert ved tilsetning av substratet (ABTS), hvoretter den relative aktiviteten ble målt.
Resultatene våre stemmer overens med resultatene til andre forfattere som fant at Mg²⁺ og Cu²⁺ forsterker aktiviteten til *Trametes polyzona* WRF03³. Castaño et al.⁴⁸ fant at lakkase fra *Xylaria* sp. stimuleres til en viss grad av kobberioner (Cu²⁺). Videre utførte Foroutanfar et al.⁴⁹ og Si et al.⁵⁰ lignende studier på lakkaser fra henholdsvis *Paraconiothyrium variabile* og *Trametes pubescens*. Kobberbindingsstedet av type II (T2) til dette enzymet kan mettes med Cu²⁺ ved en gitt konsentrasjon, noe som kan forklare stimuleringen av lakkaseaktivitet ved høyere Cu²⁺³⁹-konsentrasjoner. Siden hvitråtesopp-lakkaser er oksidaser som inneholder flere kobberatomer, er effektene av kobberioner på lakkaseaktivitet varierte og varierer fra stimulerende og hemmende til nøytrale.⁵¹ I motsetning til dette har Zhou et al.[52]rapporterte atCu²⁺hemmet lakkaseaktiviteten til taiwansk underjordisk termitt (Odontotermes formosanus). Imidlertid har lakkaser av Cerena sp. HYB07[53]og Clitocybe maxima[54]ble ikke påvirket av kobberioner.
Substratspesifisiteten ble representert ved dens kinetiske parametere (Km og Vmax); jo sterkere bindingsaffiniteten til substratet til enzymet var, desto lavere var Km-verdien og desto høyere var substratspesifisiteten.3,21,55De kinetiske parametrene (Km og Vmax) for lakkase fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ble bestemt ved hjelp av GraphPad Prism 6.0-programvaren ved å plotte Lineweaver-Burk-plottet (figur 5). Ved bruk av ABTS som substrat var resultatene 1,99 mM og 16217 μmol.min⁻¹ L⁻¹,henholdsvis Elsayed et al.21rapporterte at Km-verdiene for ABTS-oksidasjon var henholdsvis 0,1 mM og 0,064 mM, noe som indikerer en høy affinitet av Lac A- og Lac B-isoenzymer for ABTS. Videre var Vmax-verdiene 0,182 μmol.min⁻¹og 0,603 μmolmin⁻¹, henholdsvis. Den oppnådde Km-verdien var lavere enn den for Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); dessuten var deres Vmax-verdi (1429 mmol min⁻¹) ogsåsenkeved bruk av ABTS som substrat.33 Tilsvarende var Km-verdiene for konsentrasjonene av lakkase hos Lentinus squarrosulus MR13 og Trametes sp. AH28-2 henholdsvis 0,0714 mM og 0,025 mM, og Vmax-verdiene var 0,0091 mM min−1 og 0,67 mM min−1 mg−1 (i forhold til ABTS)henholdsvis.56,57
Effekten av ABTS-konsentrasjon på aktiviteten til lakkase fra *Pleurotus ostreatus* NRC 620 ble undersøkt, og et Lineweaver-Burk-plott av den resiproke verdien av den initiale reaksjonshastigheten versus ABTS-konsentrasjonen ble plottet. Oksidasjonsreaksjonen av ABTS med forskjellige konsentrasjoner (0,025–3,0 mM) lakkase ble målt ved pH 4,5 for å bestemme de kinetiske parametrene (Vmax og Km). De kinetiske konstantene for Michaelis-Menten ble beregnet ved hjelp av Lineweaver-Burk-plottet av den resiproke verdien av reaksjonshastigheten versus substratkonsentrasjonen. De kinetiske konstantene ble beregnet fra Lineweaver-Burk-plottet ved hjelp av GraphPad Prism 6.01-programvaren.
Tradisjonelle klaringsenzymer, som pektinaser, hydrolyserer pektinstoffer, noe som reduserer viskositet og turbiditet. De bryter effektivt ned strukturelle polysakkarider og brukes ofte i kombinasjon med andre enzymer, som cellulaser og hemicellulaser, for å forbedre utbytte og klarhet. Pektinaser er imidlertid ikke spesifikt rettet mot fenolforbindelser, som er de viktigste bidragsyterne til turbiditet og oksidativ bruning, spesielt i juice som eple- og druejuice.58I motsetning til dette katalyserer lakkaser oksidasjonen av fenolforbindelser, og polymeriserer dem til større, uløselige molekyler som kan fjernes ved sedimentering eller filtrering. Denne mekanismen forbedrer ikke bare klarheten, men forlenger også holdbarheten til juice ved å redusere sannsynligheten for oksidativ bruning forårsaket av fenolforbindelser. Videre kan lakkasebaserte klaringprosesser utføres under milde prosesseringsforhold (pH 3,5–5,5, temperatur 25–40 °C), noe som gjør dem egnet for delikate juicer uten å gå på kompromiss med deres ernæringsmessige eller organoleptiske egenskaper.59Studier har vist at pektinasebehandling kan klargjøre juice på 1–2 timer, mens lakkasebehandling vanligvis krever en lengre reaksjonstid (3–6 timer) for å redusere fenolforbindelser fullstendig. Denne prosessen kan imidlertid optimaliseres ved å immobilisere enzymet eller ved å kombinere lakkase med mekaniske klaringsmetoder.60I denne studien avdekket enzymprofilering av råekstraktet betydelig lakkase- og α-amylase-aktivitet, mens pektinase- og xylanase-aktiviteten var ekstremt lav, og cellulase-aktivitet ikke ble påvist. Derfor skyldtes reduksjonen i turbiditet og fenolinnhold hovedsakelig lakkases virkning, mens endringen i viskositet delvis kan skyldes amylases virkning.
Tabell 1 viser de fysikalsk-kjemiske parametrene for ferskpresset eplejuice og lakkasebehandlede prøver. Resultatene viste at utbyttet av ferskpresset eplejuice (71,59 %) var lavere enn for lakkasebehandlede prøver (87,34 %). Disse resultatene er i samsvar med funnene til Pilnik og Orange.61, som indikerte at bruk av enzymer i fruktforedling kan øke juiceutbyttet, forbedre filtreringen og oppnå klar juice av høy kvalitet for konsentrering. Økningen i juiceutbytte skyldes hovedsakelig økningen i innholdet av løselig sukker i juicen. Under enzymatisk hydrolyse av frukt ødelegges mesoglea og pektin i produktets cellevegger og omdannes til løselige stoffer som nøytrale sukkerarter og syrer.62.pH-verdien til den enzymbehandlede eplejuicen var betydelig lavere enn kontrollgruppens (P < 0,05), og pH-verdien til begge gruppene økte betydelig under lagring (tabell 1). Disse resultatene er i samsvar med resultatene til Mark et al.63, som bemerket at pH-verdien i cashewfruktjuice sank etter lagring etter varmebehandling. Pektinnedbrytning og dannelse av galakturonsyre etter enzymbehandling kan være ansvarlig for økningen i pH under lagring. PH-verdien i enzymbehandlede prøver forble mellom 4,05 og 4,31 gjennom hele lagringen, mens pH-verdien i ubehandlet eplejuice varierte mellom 4,12 og 4,33.
Den totale surhetsgraden (TA) for både ubehandlede og lakkasebehandlede prøver viste en synkende trend med økende lagringstid (tabell 1). Nedgangen i surhetsgrad ble tilskrevet omdannelsen av organiske syrer til karbohydrater eller enzymatiske reaksjoner, samt oksidasjon under lagring av juice.64Den totale surhetsgraden i kontrollprøvene av eplejuice og enzymbehandlede prøver var lavere enn for andre juicer (jordbærjuice 0,9 %, plommejuice 2,2 %, kumquatjuice 1,0 %, aprikosjuice 2,4 %, appelsinjuice 0,8 %), men lik den for andre juicer (f.eks. pærejuice 0,3 %).62Disse forskjellene i ubehandlet ferskpresset eplejuice kan skyldes ulike faktorer som vekstforhold, genetiske faktorer, modenhetsnivå og bearbeidingsmetoder.65Nedgangen i total surhetsgrad i kontroll- og lakkasebehandlet eplejuice er i samsvar med resultatene presentert av Singh et al.66angående reduksjonen i total surhetsgrad i Jin Nuo-eplejuice etter 74 dagers lagring. På den annen side, Oshmiansky og Wojdylo67fant ingen signifikante endringer i surhetsgraden til eplejuice da de studerte effekten av tradisjonelle klaringsmetoder.
Resultatene presentert i tabell 1 indikerer at verdien av totalt løselig tørrstoff (TSS) i den lakkasebehandlede eplejuicen var høyere enn i den ubehandlede prøven. Disse resultatene er i samsvar med de publiserte studiene.. 68Videre viser tabell 1 at TSS-verdien for kontrollgruppen med eplejuice var 9,58 ved det opprinnelige tidspunktet og nådde 11,05 ved slutten av lagringsperioden. Disse verdiene er lavere enn TSS-verdiene for fersk eplejuice rapportert av Hamid et al.. 69(henholdsvis 11,2 og 11,80). TSS-verdien for de lakkasebehandlede eplejuiceprøvene økte betydelig, fra 11,23 til 12,93 etter to ukers lagring ved 4 °C (tabell 1). En lignende økning i TSS under lagring ble også observert i sitrusfrukter, sitroner og søte appelsiner. Økningen i totalt løselig tørrstoff (TSS) under lagring kan skyldes hydrolyse av polysakkarider (stivelse) til monosakkarider (sukkerarter), økning i konsentrasjon på grunn av dehydrering av juice og nedbrytning av pektin i juicen til løselig tørrstoff. Økningen i totalt løselig tørrstoff (TSS) skyldes sannsynligvis økningen i løselig sukker, som kan dannes ved omdannelse av pektin eller cellulose til løselig sukker av henholdsvis pektin eller cellulase, eller ved hydrolyse av stivelse til sukkerarter, som rapportert av Hamed et al.69.Effekten av lakkase på egenskapene til eplejuice kan observeres visuelt, ettersom lakkasebehandlet eplejuice viser bedre flyteevne og lavere viskositet enn ubehandlet juice. Denne observasjonen er registrert i tabell 1; Viskositeten til den enzymbehandlede prøven var 1,87 cP, mens viskositeten til kontrollprøven var 2,95 cP. Denne signifikante reduksjonen i viskositet skyldes sannsynligvis den høyere vannholdende kapasiteten til pektinlignende stoffer og dannelsen av en kohesiv nettverksstruktur.
I denne studien ble effekten av lakkase på bruningsindeksen (BI) til eplejuice undersøkt ved å måle absorbansen ved 420 nm ved hjelp av et spektrofotometer. Resultatene er vist i tabell 1. Under lagring viste BI for eplejuiceprøver i både den behandlede og ubehandlede gruppen en gradvis økende trend. BI gjenspeiler graden av bruning og kan tjene somen viktigindikator på enzymatiske og ikke-enzymatiske bruningsreaksjoner. Absorbansen økte betydelig under lagring (P < 0,05). Ved slutten av lagringen varA420Verdien av eplejuiceprøvene i kontrollgruppen og den enzymbehandlede gruppen økte med henholdsvis omtrent 217 % og 121 % (tabell 1). Resultatene indikerer at enzymbehandling effektivt kan redusere bruningsgraden med omtrent 56 %. Resultatene til Bezerra et al.[19]] stemmer overens med resultatene våre; De brukte lakkase-glutaraldehyd-kokosfiber for å klarne eplejuice, noe som reduserte den opprinnelige fargen med 61 %.
Selv om polyfenoler i fruktjuicer har positive ernæringsmessige og terapeutiske effekter på menneskekroppen, kan de også reagere med proteiner, noe som forårsaker uklarhet, sedimentasjon eller turbiditet i juicen, og dermed endre produktets smak og aroma og redusere holdbarheten.71Målet med denne studien var å redusere innholdet av fenolforbindelser i eplejuice på en sikker måte ved bruk av lakkase fra Pleurotus ostreatus NRC 620. Resultatene presentert i tabell 1 viser at det totale innholdet av fenolforbindelser i lakkasebehandlet eplejuice ble betydelig redusert før lagring ved 4 °C. Videre minket også det totale innholdet av fenolforbindelser under lagring i begge prøvene som ble studert (tabell 1). Forskning av Sandri et al.72viste at enzymbehandlet eplejuice kan beholde sin antioksidantaktivitet og innhold av fenolforbindelser. Resultatene av en studie av Lettera et al.73viser at behandling av appelsinjuice med sopplakkase kan redusere innholdet av fenolforbindelser i den med opptil 45 %.
Fenoliske forbindelser har vist seg å ha egenskaper som fjerning av frie radikaler, reduksjon og slokking av singlett-oksygen, overføring av hydrogenatomer og elektrondonasjon til frie radikaler, noe som gjør dem til potente antioksidanter.74Derfor ble DPPH- og FRAP-baserte metoder brukt i denne studien for å evaluere effekten av lakkase på antioksidantaktiviteten til eplejuice lagret i kjøleskap i 14 dager (tabell 2). Begge metodene viste en økning i antioksidantaktivitet under lagring, noe som kan skyldes økningen i frie fenolforbindelser eller dannelsen av Maillard-reaksjonsprodukter (MRP-er), hvor Maillard-reaksjonsprodukter sannsynligvis er årsaken til økningen i antioksidantaktivitet.75Ikke-enzymatiske bruningsreaksjoner (inkludert askorbinsyrenedbrytning, Maillard-reaksjoner og syrekatalysert nedbrytning av sukkerarter) produserer brune pigmenter (melanoidiner). Mellomliggende askorbinsyrenedbrytningsprodukter og sukkernedbrytningsprodukter (som karbonylforbindelser) kan reagere med aminosyrer gjennom Maillard-reaksjoner.76Selv om bruning av frukt og grønnsaker under lagring har blitt grundig studert, er vår forståelse av disse reaksjonene fortsatt begrenset.77Sammenlignet med FRAP-metoden viste lakkasebehandlet eplejuice signifikant lavere antioksidantaktivitet ved bruk av DPPH-metoden (tabell 2), og antioksidantaktiviteten til alle prøvene økte betydelig med økende lagringstid. To forskjellige metoder for å bestemme antioksidantaktivitet ble brukt i denne studien fordi prinsippene deres er forskjellige. DPPH-metoden måler evnen til å nøytralisere frie radikaler, mens FRAP-metoden måler evnen til å redusere jernioner. Derfor anbefales det å bruke flere metoder for å bestemme antioksidantaktivitet for å bedre forstå antioksidantaktiviteten til prøvene som studeres.78
Et av hovedfunnene i denne studien er at *Pleurotus ostreatus*-lakkase NRC 620 viser optimal aktivitet ved 70 °C og pH 3,0. Sammenlignet med andre soppelakkaser som vanligvis brukes til klaring av juice, som *Trametes versicolor*- og *Ganoderma lucidum*-lakkaser, viser *P. ostreatus* NRC 620 høyere termisk stabilitet og en surere pH. Lakkaser fra *Trametes versicolor* og *Ganoderma lucidum* viser vanligvis optimal aktivitet i området 50–60 °C og ved pH-verdier mellom 3,5 og 5,0. Denne forskjellen kan bidra til forbedret klaring av juice, spesielt for sure juicer der stabilitet ved lavere pH-verdier er kritisk. Den unike egenskapen til *P. Sammenlignet med andre studerte soppelakkaser, viser *Pleurotus ostreatus* NRC 620 evnen til å fungere effektivt under mer utfordrende forhold. Den høyere optimale aktivitetstemperaturen antyder potensielle fordeler i industrielle anvendelser, som raskere reaksjonshastigheter og redusert mikrobiell forurensning. Den lave pH-verdien, som er godt egnet til den sure naturen til mange juicer, kan være nyttig i juiceklargjøringsprosesser. Disse resultatene rettferdiggjør videre utforskning for storskala anvendelse, noe som gjør *Pleurotus ostreatus* NRC 620 til et levedyktig alternativ til tradisjonelle sopplakkasekilder. Sammenlignet med tidligere studier fant vi at den optimale temperaturen er 60 °C og den optimale pH-verdien er 3,0. Etter reaksjon ved 60 °C i 80 minutter beholdt *Ganoderma lucidum*-lakkase46% av aktiviteten.79 Ifølge Kurniawati og Nicelle80*Ganoderma lucidum*-enzymer viser utmerket til moderat stabilitet ved 25 °C og pH-verdier fra 5,0 til 8,0, og stabilitet ved pH 6,0 og temperaturer fra 10 til 30 °C. I denne studien fant vi at optimal pH og temperatur for enzymaktivitet for *Pleurotus ostreatus* var henholdsvis 3,0 og 70 °C. Etter inkubasjon ved 40 °C og 50 °C i to timer beholdt enzymet henholdsvis 68,33 % og 59,61 % av aktiviteten. Videre viste Pleurotus ostreatus NRC 620-lakkase høy aktivitet over et bredt temperaturområde fra 50 °C til 80 °C, og nådde nesten maksimal aktivitet (69 %–98 %), med maksimal aktivitet observert ved 70 °C.
Avslutningsvis viste østerssopplakkase NRC620, oppnådd under statiske forhold, optimal aktivitet og stabilitet over en rekke pH- og temperaturforhold, og demonstrerte overlegen stabilitet sammenlignet med andre enzymkilder. Tilsetning av 10 mM MgSO₄ og CuSO₄ økte enzymaktiviteten med henholdsvis omtrent 21 % og 35 %. Når enzymet ble bearbeidet til eplejuice, reduserte det pH og viskositet, mens fenolinnholdet bare minket litt under lagring.
Resultatene bekrefter potensialet til lakkase i næringsmiddelindustrien, spesielt innen klaring av drikkevarer. Ved å spesifikt bryte ned fenolforbindelser reduserer lakkase ikke bare turbiditet og forbedrer klarheten, men opprettholder også kvaliteten på fruktjuicer under milde driftsforhold. I motsetning til tradisjonelle klaringsmidler som gelatin, bentonitt og silikagel, genererer ikke lakkase avfall eller fjerner behagelige aromaer fra drikkevarer, noe som gjør den til et mer miljøvennlig og bærekraftig alternativ. Sammenlignet med andre enzymer og filtreringsmetoder tilbyr lakkase dessuten en målrettet og kostnadseffektiv løsning uten at det går på bekostning av produktkvaliteten.
Kyomuhimbo, HD og Brink, HG. Anvendelser og immobiliseringsstrategier for kobberholdige lakkaser; en oversikt. Heliyon 9, e13156 (2023).
Publiseringstid: 15. desember 2025